ELISA試劑盒使用中酶結(jié)合過程
酶結(jié)合物即酶標(biāo)記物（或抗原）,是ELISA中最關(guān)鍵的試劑。良好的酶結(jié)合物應(yīng)該是既有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性。結(jié)合物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當(dāng)?shù)姆肿颖壤诮Y(jié)合試劑中應(yīng)精良不含有貨不含有游離的（未結(jié)合的）酶活游離的抗體（或抗原）.此外，酶結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。
酶
用于ELISA的酶應(yīng)符合以下要求：純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富，價格不貴，制備成酶結(jié)合物后仍繼續(xù)保留他的活性部分和催化能力。最好在受檢標(biāo)本易于測定等。在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶 和踐行磷酸酶 在少數(shù)商品ELISA中應(yīng)用酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等、
國產(chǎn)ELISA試劑盒中一般采用HRP制備結(jié)合物。HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%分子量為44000KD，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵紅蛋白素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)，主酶無色糖蛋白在275nm波長處有最高吸收峰，輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán)，在403nm波長處有最高吸收峰。HRP的純度用RZ標(biāo)示，是403nm的吸收度與280nm吸光度之比。高純度的HRP的RZ大于等于3.0
HRP除符合上述的ELISA中標(biāo)記酶的要求外，更有價格低廉和性質(zhì)較為穩(wěn)定的等特定，值得注意的是，在選用酶制劑時，處其純度外，跟應(yīng)該注意沒的活力。高純度的酶如果保存不當(dāng)，活力也會降低。酶制劑的活力以所含的酶活力單位標(biāo)示，可用對底物作用后生成產(chǎn)物量的測定進(jìn)行試驗。
抗原和抗體
制備結(jié)合物時采用抗體一般為純度較高的IgG，以免在酶聯(lián)結(jié)室其他雜蛋白干擾。最好用親和層析純的抗體，這樣全部酶結(jié)合物均具有特意的免疫活性，可以再高稀釋度進(jìn)行反應(yīng)，實驗結(jié)果本底干凈。如果F（ab)2進(jìn)行標(biāo)記，則更可避免標(biāo)本中RF的干擾。在ELISA中用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的
ELISA-酶結(jié)合物的制備
酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種：戊二醛交聯(lián)法和國電酸鹽氧化法。
戊二醛交聯(lián)法
戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，他可以使酶與蛋白質(zhì)氨基酸通過它二鏈接。堿性磷酸一般用此法進(jìn)行標(biāo)記。交聯(lián)方法分一步走兩步走兩種。在一部法中戊二醛直接加入酶與抗體的混合物中，反應(yīng)后記得酶標(biāo)記抗體。
ELISA中常用的酶一般用此法交聯(lián)。它具有操作簡便，有效和重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是交聯(lián)反應(yīng)時隨機(jī)的。酶與抗體交聯(lián)時分子間的比例不嚴(yán)格，結(jié)合物的大小不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有坑內(nèi)交聯(lián)，影響效果，在兩步法中，先將酶與戊二醛作用，在于酶酶結(jié)合。兩步法的產(chǎn)額不中絕大部分的酶與蛋白質(zhì)是1:1的比例結(jié)合。較一步法的酶結(jié)合物更有助于本底的改善以提高靈敏度但其偶聯(lián)的有效率較一步法差。
ELISA-酶結(jié)合物的保存
沒變抗體中酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，保存不當(dāng)，極易失活。高濃度的結(jié)合物較為穩(wěn)定，冰凍干燥后可在普通冰箱中保存1年左右，但凍干過程中引起活力的減低，而且使用時需經(jīng)復(fù)溶，頗為不變。結(jié)合物溶液中加入燈體的甘油可在低溫冰箱或普通冰箱中較長時間保存。早期的ELISA試劑盒中的結(jié)合物一般均按以上兩種形式供應(yīng)，配制稀釋液，臨用時按表明的稀釋度稀釋成工作液�，F(xiàn)在先進(jìn)的ELISA試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作也，使用時不需再行稀釋，在4-8攝氏度保存期長達(dá)6個月。由于蛋白質(zhì)濃度較低，結(jié)合物易失活。需要加入蛋白保護(hù)劑，聯(lián)外加入抗生素和防腐劑以防止細(xì)菌聲場。
ELISA-酶結(jié)合物的稀釋液
用于稀釋高濃度的結(jié)合物一賠成工作也。為避免結(jié)合物在反應(yīng)中直接吸附在固相載體上，在稀釋緩沖液中常加入高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)，通常競爭抑制結(jié)合物的吸附，一般還加入具有抑制蛋白吸附于塑料表面的非離子型活性劑。如圖為-20 ，0.5%的濃度較為適宜。在間接測定抗體時，血清標(biāo)本須稀釋后驚醒測定，也可應(yīng)用這種稀釋液
ELISA-酶的底物
HRP的底物
HRP催化過氧化物的氧化反應(yīng)，應(yīng)最具代表性的過氧化物為H2O2其反應(yīng)式如下
DH2+H2O2→D+2H2O
上式中，DH2wei 供氧體，H2O2為受氫體。在ELISA中DH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后生成有色的產(chǎn)物，以便作比色測定。常用的供氫體為鄰苯二胺、四甲基聯(lián)苯胺、ABTS。OPD本身難溶于水，OPD和H2O2一般分成二組分，OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式。片劑中含有發(fā)泡助溶劑，使用更為方便。過啊氧化氫則胚乳底物緩沖液中，有支撐一曹村的濃縮液，使用時用蒸餾水稀釋。陷阱的萬里沙試劑盒中則直接配成含寶貝虎劑的工作濃度為0.02%H2O2的應(yīng)用液，只需加入OPD即可作為底物應(yīng)用液。TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色，木事對比鮮明。TMB性質(zhì)穩(wěn)定可配成溶液試劑。只需與H2O2溶液混合既成應(yīng)用液，可直接做底物使用。另外,TMB無致癌性等優(yōu)點(diǎn)，因此ELISA中應(yīng)用日趨廣泛。酶反應(yīng)用HCL和H2SO4終止后，TMBA產(chǎn)物有藍(lán)色呈黃色，可在比色中定量，最適吸收波長為405nm。
ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些實際和所采用。
另一種HRP的底物為3-（4-羥基）苯丙酸經(jīng)HRP作用后，產(chǎn)物顯熒光，可用熒光光度計測量。用于ELISA有點(diǎn)味可加寬定量測定的線性范圍
HRP對氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2、小分子醇的過氧化物和尿素過氧化物。H2O2應(yīng)用最多，但尿素過氧化物為固體，作為試劑較H2O2方便，穩(wěn)定。試劑盒供應(yīng)尿素過氧化物片劑，用蒸餾水溶解后，在底物緩沖液中密閉，低溫（2--8℃）可穩(wěn)定1年。
AP的底物
AP為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯作為底物，可制成片劑，使用方便。產(chǎn)物為黃色的對硝基苯分，在405nm波長處有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一段時間。AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮）,可用于ELISA作熒光測定，敏感度較高于顯色底物的比色法。
ELISA洗滌液
在板式ELISA中，常用的稀釋液為磷酸緩沖液或Tris-HCL緩沖液，加入0.05%Tween-20可加強(qiáng)去除非特異性反應(yīng)的作用。一些洗滌儀器設(shè)計有特殊的沖洗裝置，用蒸餾水做洗滌液，同樣有徹底洗滌的效果。
ELISA終止液
常用HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在辦事ELISA中一般采用2mol/L
陽性對照品和陰性對照品
陽性對照品和陰性對照品是檢驗試驗有效性的控制品，同時也做為判斷結(jié)果的對照，因此對照品，特備是陽性對照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測標(biāo)本的組成相一致。以人血清為標(biāo)本的測定，對照品最好也為人血清因為正常人許晴在跟中ELISA模式中可產(chǎn)生不同程度的本底。由于大量正常人血清較難得到，國外試劑盒中的對照品多以復(fù)鈣人血漿為原料，記載血漿中加入鈣離子，十七中的纖維蛋白質(zhì)凝固，出去凝塊后所得的液體，其組成與血清相同
陰性對照品現(xiàn)行檢測，去頂其中不含待測物質(zhì)。例如HBsAg檢測的陰性對照品中不可含HBsAg,UI好抗HBs也是陰性。陽性對照品多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基礎(chǔ)，其中加入一定量的待檢物質(zhì)。加入的量英語試劑敏感度相稱，在代測中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可對標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量有個粗略的估計。
代測樣品：
可用作ELISA測定的標(biāo)本十分廣泛，血清、血漿或其他體液均可作為酶免疫測定法中使用的大側(cè)標(biāo)本，代測標(biāo)本的質(zhì)量液影響最后的測定結(jié)果。標(biāo)本中蛋白質(zhì)濃度過高會產(chǎn)生非特異性吸附干擾固相包被，而過分稀釋的血清或血漿會影響抗原-抗體之間的免疫學(xué)反應(yīng)，標(biāo)本中可能存在的內(nèi)源性過氧化物酶會干擾顯色反應(yīng)等，客服或減少這些問題的最簡單拌飯Shiite采用適當(dāng)?shù)南♂屴k法，再去定包被液濃度、酶結(jié)合物濃度及孵育時間后，將達(dá)側(cè)血清標(biāo)本不同程度的稀釋后按elisa生產(chǎn)工藝操作，比較血清各稀釋度反應(yīng)后測得吸光度值，一般去值為1.0時稀釋度為宜。然而稀釋法雖然可減少樣品中的蛋白質(zhì)或其他成分火谷鄉(xiāng)菲特西行結(jié)合及降低底物反應(yīng)式的非特異性顯示程度，但也可能降低酶免疫法的檢測的敏感性。
人血清中的自身抗體成分，特別是類風(fēng)濕因子對雙抗體夾心法次頂有一定影響。是造成假陽性反應(yīng)的原因之一，測定HBsAg或甲胎蛋白時常出現(xiàn)假陽性結(jié)果。因此HBsAg篩選實驗陽性者還要用抗-HBs中和后做確診實驗，測AFP時則在標(biāo)本中先用已加熱聚合的人IgG與可能存在的類風(fēng)濕因子反應(yīng)，已消除類風(fēng)濕因子的干擾作用。保存的血清標(biāo)本切忌反復(fù)凍融，以免降低血清中的抗體或抗原的免疫活性。分離血清最好是讓血液在室溫中放置一定時間，使其自然凝固后將許晴析出，血液標(biāo)本不宜置于4℃下凝固，以防丟失大量的IgM及部分IgO.
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